1. О производњи епрувета за узорковање вируса
Епрувете за узорковање вируса припадају производима медицинских средстава. Већина домаћих произвођача је регистрована према производима прве класе, а мало компанија је регистровано према производима друге класе. Недавно су, како би задовољиле хитне потребе Вухана и других места, многе компаније предузеле „канал за хитне случајеве“ „Поднесите захтев за дозволу за евиденцију прве класе“. Епрувета за узорковање вируса састоји се од бриса за узорковање, раствора за конзервацију вируса и спољашњег паковања. Пошто не постоји јединствени национални стандард или индустријски стандард, производи различитих произвођача се веома разликују.
1. Брис за узорковање: Брис за узорковање директно додирује место узорковања, а материјал главе за узорковање је уско повезан са каснијом детекцијом. Глава бриса за узорковање треба да буде направљена од синтетичких влакана од полиестера (ПЕ) или рајона (вештачких влакана). Не могу се користити сунђер од калцијум алгината или дрвени штапићи (укључујући бамбусове штапиће), а материјал главе бриса не сме бити од памучних производа. Пошто памучна влакна имају јаку адсорпцију протеина, није их лако елуирати у накнадни раствор за складиштење; а када се дрвени штапић или бамбусов штапић који садржи калцијум алгинат и дрвене компоненте поломи, намакање у раствору за складиштење ће такође адсорбовати протеине, па чак и може инхибирати каснију ПЦР реакцију. Препоручује се употреба синтетичких влакана као што су ПЕ влакна, полиестерска влакна и полипропиленска влакна за материјал главе бриса. Природна влакна попут памука се не препоручују. Најлонска влакна се такође не препоручују јер најлонска влакна (слично главама четкица за зубе) лоше апсорбују воду, што резултира недовољном запремином узорковања, што утиче на стопу детекције. Сунђер од калцијум алгината је забрањен за узорковање материјала за брис! Дршка бриса има две врсте: поломљена и уграђена. Поломљени штапић се ставља у епрувету за складиштење након узорковања, а поклопац епрувете се ломи након ломљења са положаја близу главе за узорковање; уграђени штапић директно ставља штапић за узорковање у епрувету за складиштење након узорковања, а поклопац епрувете за складиштење се уграђује. Поравнајте мали отвор са врхом дршке и затегните поклопац епрувете. Упоређујући две методе, друга је релативно безбедна. Када се поломљени штапић користи у комбинацији са епруветом за складиштење мање величине, може доћи до прскања течности у епрувети када се поломи, и треба обратити пуну пажњу на ризик од контаминације изазване неправилном употребом производа. Препоручује се употреба шупље екструдиране цеви од полистирена (PS) или цеви од полипропилена (PP) за бризгање као материјал дршке штапића. Без обзира на материјал који се користи, не могу се додавати адитиви калцијум алгината; дрвени штапићи или бамбусови штапићи. Укратко, штапић за узорковање треба да обезбеди количину узорковања и количину ослобађања, а одабрани материјали не смеју садржати супстанце које утичу на накнадно тестирање.
2. Раствор за очување вируса: На тржишту се широко користе две врсте раствора за очување вируса, један је раствор за одржавање вируса модификован на основу транспортног медијума, а други је модификовани раствор за екстракцију лизата нуклеинских киселина.
Главна компонента првог је Иглов основни медијум за култивацију (МЕМ) или Ханкова уравнотежена со, којој се додају соли, аминокиселине, витамини, глукоза и протеини неопходни за преживљавање вируса. Овај раствор за складиштење користи фенол црвену натријумову со као индикатор и раствор. Када је pH вредност 6,6-8,0, раствор је ружичаст. Потребна глукоза, Л-глутамин и протеини се додају у раствор за конзервацију. Протеин се обезбеђује у облику феталног говеђег серума или говеђег серумског албумина, који може стабилизовати протеинску љуску вируса. Пошто је раствор за конзервацију богат хранљивим материјама, погодан је за преживљавање вируса, али је такође користан за раст бактерија. Ако је раствор за конзервацију контаминиран бактеријама, оне ће се размножавати у великим количинама. Угљен-диоксид у његовим метаболитима ће узроковати да pH раствора за конзервацију падне из ружичасте у жуту. Због тога је већина произвођача додала антибактеријске састојке у своје формулације. Препоручени антибактеријски агенси су пеницилин, стрептомицин, гентамицин и полимиксин Б. Натријум азид и 2-метил се не препоручују. Инхибитори као што су 4-метил-4-изотиазолин-3-он (MCI) и 5-хлоро-2-метил-4-изотиазолин-3-он (CMCI) јер ове компоненте утичу на PCR реакцију. Пошто је узорак који се добија овим раствором за конзервацију у основи живи вирус, оригиналност узорка се може сачувати у највећој мери и може се користити не само за екстракцију и детекцију нуклеинских киселина вируса, већ и за култивацију и изолацију вируса. Међутим, треба напоменути да када се користи за детекцију, екстракција и пречишћавање нуклеинских киселина морају се извршити након инактивације.
Друга врста раствора за конзервацију припремљена је на бази лизата за екстракцију нуклеинских киселина, чије су главне компоненте уравнотежене соли, хелатни агенс EDTA, гванидин со (као што је гванидин изотиоцијанат, гванидин хидрохлорид итд.), анионски сурфактант (као што је додекан натријум сулфат), катјонски сурфактанти (као што је тетрадецилтриметиламонијум оксалат), фенол, 8-хидроксихинолин, дитиотреитол (DTT), протеиназа К и друге компоненте. Овај раствор за складиштење служи за директно раздвајање вируса како би се ослободила нуклеинска киселина и елиминисала RNase. Ако се користи само за RT-PCR, погоднији је, али лизат може инактивирати вирус. Ова врста узорка се не може користити за раздвајање вирусне културе.
Препоручује се употреба хелатног средства металних јона које се користи у раствору за очување вируса у облику ЕДТА соли (као што је дикалијум етилендиаминтетрасирћетна киселина, динатријум етилендиаминтетрасирћетна киселина итд.), а не препоручује се употреба хепарина (као што је натријум хепарин, литијум хепарин), како не би утицало на ПЦР детекцију.
3. Цев за конзервацију: Материјал цеви за конзервацију треба пажљиво одабрати. Постоје подаци који указују на то да је полипропилен (полипропилен) повезан са адсорпцијом нуклеинских киселина, посебно при високој концентрацији јона, полиетилен (полиетилен) је пожељнији од полипропилена (полипропилена). ДНК/РНК се лако држи. Полиетилен-пропилен полимерна (полиаломерна) пластика и неки специјално обрађени полипропиленски (полипропилен) пластични контејнери су погоднији за складиштење ДНК/РНК. Поред тога, када се користи ломљиви штапић, требало би одабрати посуду висине веће од 8 цм како би се спречило прскање и контаминација садржаја када се штапић поломи.
4. Вода за производни раствор за конзервацију: Ултрачиста вода која се користи за производни раствор за конзервацију треба да се филтрира кроз ултрафилтрациону мембрану молекулске тежине 13.000 како би се осигурало уклањање полимерних нечистоћа из биолошких извора, као што су РНаза, ДНаза и ендотоксин, а обично пречишћавање се не препоручује. Вода или дестилована вода.
2. Употреба епрувета за узорковање вируса
Узорковање помоћу епрувете за узорковање вируса углавном се дели на орофарингеално узорковање и назофарингеално узорковање:
1. Узорковање орофаринкса: Прво притисните језик депресором језика, затим продужите главу брисача за узорковање у грло да бисте обрисали билатералне фарингеалне крајнике и задњи зид ждрела, а затим обришите задњи зид ждрела лаганом силом, избегавајући додиривање језичке јединице.
2. Узимање узорка из назофаринкса: измерити растојање од врха носа до ушне режње штапићем и означити прстом, уметнути штапић за узорковање у носну шупљину у правцу вертикалног носа (лица), штапић треба да се протеже најмање половином дужине ушне режње до врха носа, оставити штапић у носу 15-30 секунди, нежно ротирати 3-5 пута и извући штапић.
Није тешко видети из начина употребе, било да је у питању орофарингеални или назофарингеални брис, узорковање је технички задатак, који је тежак и контаминиран. Квалитет прикупљеног узорка је директно повезан са накнадним откривањем. Ако прикупљени узорак има ниско вирусно оптерећење, лако је изазвати лажно негативне резултате, тешко је потврдити дијагнозу.
Време објаве: 21. јун 2020.
