1. O izdelavi epruvet za vzorčenje virusov
Epruvete za vzorčenje virusov spadajo med medicinske pripomočke. Večina domačih proizvajalcev je registriranih kot izdelki prvega razreda, le malo podjetij pa kot izdelki drugega razreda. V zadnjem času so številna podjetja, da bi zadostila potrebam v nujnih primerih v Wuhanu in drugih krajih, izbrala "kanal za nujne primere" in zahtevala dovoljenje za prvovrstne zapise. Epruveta za vzorčenje virusov je sestavljena iz vzorčnega brisa, raztopine za shranjevanje virusov in zunanje embalaže. Ker ni enotnega nacionalnega ali industrijskega standarda, se izdelki različnih proizvajalcev zelo razlikujejo.
1. Vzorec brisa: Vzorec brisa se neposredno dotika mesta vzorčenja, material glave vzorca pa je tesno povezan s kasnejšim zaznavanjem. Glava vzorca brisa mora biti izdelana iz sintetičnih vlaken iz poliestra (PE) ali rajona (umetnih vlaken). Gobice iz kalcijevega alginata ali lesene palčke (vključno z bambusovimi palicami) se ne smejo uporabljati, material glave brisa pa ne sme biti bombažni. Ker bombažna vlakna močno adsorbirajo beljakovine, jih ni enostavno eluirati v nadaljnjo raztopino za shranjevanje; in če je lesena ali bambusova palica, ki vsebuje kalcijev alginat in lesene komponente, zlomljena, bo namakanje v raztopini za shranjevanje prav tako adsorbiralo beljakovine in lahko celo zavre nadaljnjo reakcijo PCR. Za material glave brisa je priporočljivo uporabljati sintetična vlakna, kot so PE vlakna, poliestrska vlakna in polipropilenska vlakna. Naravna vlakna, kot je bombaž, niso priporočljiva. Prav tako niso priporočljiva najlonska vlakna, ker najlonska vlakna (podobno kot glave zobnih ščetk) slabo absorbirajo vodo, kar povzroči nezadostno količino vzorčenja in vpliva na stopnjo zaznavanja. Gobica iz kalcijevega alginata ni dovoljena za uporabo z materialom za vzorčenje brisa! Ročaj brisa je dveh vrst: zlomljen in vgrajen. Zlomljen bris se po vzorčenju vstavi v epruveto za shranjevanje, pokrovček epruvete pa se zlomi, ko se zlomi v bližini glave za vzorčenje; vgrajena palčka po vzorčenju neposredno vstavi palčko za vzorčenje v epruveto za shranjevanje, pokrov epruvete za shranjevanje pa je vgrajen. Poravnajte majhno luknjo z vrhom ročaja in privijte pokrov epruvete. Če primerjamo obe metodi, je slednja relativno varna. Če se zlomljen bris uporablja skupaj z manjšo epruveto za shranjevanje, lahko ob zlomu povzroči brizganje tekočine v epruveti, zato je treba biti pozoren na tveganje kontaminacije zaradi nepravilne uporabe izdelka. Za material ročaja palčke je priporočljivo uporabiti votle ekstrudirane polistirenske (PS) (cevi) ali polipropilenske (PP) (cevi za brizganje) cevi. Ne glede na uporabljeni material ni mogoče dodajati dodatkov kalcijevega alginata; lesenih ali bambusovih palic. Skratka, palčka za vzorčenje mora zagotavljati količino vzorčenja in količino sproščanja, izbrani materiali pa ne smejo vsebovati snovi, ki bi vplivale na nadaljnje testiranje.
2. Raztopina za ohranjanje virusov: Na trgu se pogosto uporabljata dve vrsti raztopin za ohranjanje virusov, ena je raztopina za vzdrževanje virusov, modificirana na podlagi transportnega medija, druga pa je modificirana raztopina za ekstrakcijo lizata nukleinskih kislin.
Glavna sestavina prvega je Eagleov osnovni gojišče (MEM) ali Hankova uravnotežena sol, ki ji dodamo soli, aminokisline, vitamine, glukozo in beljakovine, potrebne za preživetje virusa. Ta raztopina za shranjevanje uporablja natrijevo sol fenol rdečega kot indikator in raztopino. Ko je pH vrednost 6,6–8,0, je raztopina rožnata. Raztopini za shranjevanje se dodajo potrebna glukoza, L-glutamin in beljakovine. Beljakovine so v obliki fetalnega govejega seruma ali govejega serumskega albumina, ki lahko stabilizira beljakovinsko lupino virusa. Ker je raztopina za shranjevanje bogata s hranili, ne le da ne bi virus preživel, ampak tudi koristi rasti bakterij. Če je raztopina za shranjevanje kontaminirana z bakterijami, se bodo te razmnoževale v velikih količinah. Ogljikov dioksid v njegovih metabolitih bo povzročil, da se pH raztopine za shranjevanje zniža iz rožnate v rumeno. Zato večina proizvajalcev svojim formulacijam dodaja antibakterijske sestavine. Priporočena antibakterijska sredstva so penicilin, streptomicin, gentamicin in polimiksin B. Natrijev azid in 2-metil nista priporočljiva. Inhibitorji, kot sta 4-metil-4-izotiazolin-3-on (MCI) in 5-kloro-2-metil-4-izotiazolin-3-on (CMCI), niso priporočljivi, saj vplivajo na reakcijo PCR. Ker je vzorec, ki ga zagotavlja ta raztopina za konzerviranje, v osnovi živ virus, se lahko originalnost vzorca ohrani v največji možni meri in se lahko uporablja ne le za ekstrakcijo in detekcijo virusnih nukleinskih kislin, temveč tudi za gojenje in izolacijo virusov. Vendar je treba opozoriti, da je treba pri uporabi za detekcijo ekstrakcijo in čiščenje nukleinskih kislin izvesti po inaktivaciji.
Druga vrsta raztopine za shranjevanje, pripravljene na osnovi lizata za ekstrakcijo nukleinskih kislin, je raztopina, katere glavne sestavine so uravnotežene soli, kelatno sredstvo EDTA, gvanidinova sol (kot je gvanidin izotiocianat, gvanidin hidroklorid itd.), anionska površinsko aktivna snov (kot je dodekan natrijev sulfat), kationske površinsko aktivne snovi (kot je tetradeciltrimetilamonijev oksalat), fenol, 8-hidroksikinolin, ditiotreitol (DTT), proteinaza K in druge komponente. Ta raztopina za shranjevanje je namenjena neposrednemu cepljenju virusa, da se sprosti nukleinska kislina in odstrani RNaza. Če se uporablja samo za RT-PCR, je bolj primerna, vendar lahko lizat inaktivira virus. Te vrste vzorca ni mogoče uporabiti za ločevanje virusnih kultur.
Kot kelatno sredstvo kovinskih ionov, ki se uporablja v raztopini za ohranjanje virusa, je priporočljivo uporabljati soli EDTA (kot so dikalijeva etilendiamintetraocetna kislina, dinatrijeva etilendiamintetraocetna kislina itd.), uporaba heparina (kot je natrijev heparin, litijev heparin) pa ni priporočljiva, da ne bi vplivala na detekcijo PCR.
3. Epruveta za shranjevanje: Material epruvete za shranjevanje je treba skrbno izbrati. Podatki kažejo, da je polipropilen (polipropilen) povezan z adsorpcijo nukleinskih kislin, zlasti pri visoki koncentraciji ionov, zato je polietilen (polietilen) bolj zaželen kot polipropilen (polipropilen). DNK/RNA je enostavno prijeti. Za shranjevanje DNK/RNA so primernejše posode iz polietilen-propilenskega polimera (polialomera) in nekatere posebej obdelane plastične posode iz polipropilena (polipropilena). Poleg tega je treba pri uporabi lomljive palčke izbrati posodo z višino epruvete več kot 8 cm, da se prepreči brizganje in kontaminacija vsebine, ko se palčka zlomi.
4. Voda za raztopino za konzerviranje v proizvodnji: Ultračisto vodo, ki se uporablja za raztopino za konzerviranje v proizvodnji, je treba filtrirati skozi ultrafiltracijsko membrano z molekulsko maso 13.000, da se zagotovi odstranitev polimernih nečistoč iz bioloških virov, kot so RNaza, DNaza in endotoksin, in običajno čiščenje ni priporočljivo. Uporablja se voda ali destilirana voda.
2. Uporaba epruvet za vzorčenje virusov
Vzorčenje z uporabo epruvete za vzorčenje virusa se v glavnem deli na orofaringealno in nazofaringealno vzorčenje:
1. Odvzem vzorca iz orofarinksa: Najprej pritisnite jezik z depresorjem za jezik, nato pa glavo brisa za odvzem vzorca iztegnite v grlo, da obrišete obojestranske faringealne tonzile in zadnjo steno žrela, ter z rahlim pritiskom obrišite zadnjo steno žrela, pri čemer se ne dotikajte jezične enote.
2. Vzorčenje iz nazofarinksa: z palčko izmerite razdaljo od konice nosu do ušesne mečice in jo označite s prstom, palčko vstavite v nosno votlino v smeri navpične smeri nosu (obraza), palčka naj sega vsaj do polovice dolžine ušesne mečice do konice nosu. Palčko pustite v nosu 15–30 sekund, jo 3–5-krat nežno zavrtite in nato palčko izvlecite.
Iz načina uporabe ni težko razbrati, ali gre za orofaringealni ali nazofaringealni bris, saj je vzorčenje tehnična naloga, ki je zahtevna in kontaminirana. Kakovost odvzetega vzorca je neposredno povezana s poznejšim odkrivanjem. Če ima odvzeti vzorec nizko virusno obremenitev, lahko pride do lažno negativnih rezultatov in je težko potrditi diagnozo.
Čas objave: 21. junij 2020
