1. О производстве пробирок для отбора проб вирусов.
Пробирки для отбора проб вирусов относятся к медицинским изделиям. Большинство отечественных производителей зарегистрированы как продукция первого класса, и лишь немногие — как продукция второго класса. В последнее время, в связи с чрезвычайными потребностями Уханя и других мест, многие компании используют «экстренный канал» — «подали заявку на регистрацию продукции первого класса». Пробирка для отбора проб вирусов состоит из тампона для отбора проб, раствора для сохранения вируса и внешней упаковки. Поскольку единого национального стандарта или отраслевого стандарта нет, продукция различных производителей сильно различается.
1. Тампон для отбора проб: Тампон для отбора проб непосредственно контактирует с местом отбора проб, и материал головки тампона тесно связан с последующим анализом. Головка тампона должна быть изготовлена из синтетического полиэфирного (ПЭ) волокна или вискозы (искусственного волокна). Губчатые тампоны из альгината кальция или деревянные палочки (включая бамбуковые палочки) не подходят, а материал головки тампона не может быть хлопчатобумажным. Поскольку хлопковое волокно обладает сильной адсорбцией белка, ему трудно вымываться в последующий раствор для хранения; а если деревянная или бамбуковая палочка, содержащая альгинат кальция и древесные компоненты, сломается, она также будет адсорбировать белок и даже может ингибировать последующую ПЦР-реакцию. Рекомендуется использовать синтетические волокна, такие как ПЭ, полиэфирное и полипропиленовое волокно, в качестве материала головки тампона. Натуральные волокна, такие как хлопок, не рекомендуются. Нейлоновые волокна также не рекомендуются, поскольку нейлоновые волокна (подобно головкам зубных щеток) впитывают воду. Плохое качество, приводящее к недостаточному объему пробы и влияющее на эффективность обнаружения. Использование губки из альгината кальция в качестве материала для мазков запрещено! Ручка тампона бывает двух типов: со сломанной и со встроенной крышкой. Сломанный тампон помещается в пробирку для хранения после отбора пробы, а крышка пробирки отламывается в месте, близком к головке тампона; тампон со встроенной крышкой помещается непосредственно в пробирку для хранения после отбора пробы, а крышка пробирки складывается, совмещая маленькое отверстие с верхней частью ручки, и плотно закрывает крышку пробирки. Сравнивая два метода, последний является относительно безопасным. При использовании сломанного тампона в сочетании с пробиркой меньшего размера, при его поломке может произойти разбрызгивание жидкости внутри пробирки, поэтому следует уделять особое внимание риску загрязнения, вызванному неправильным использованием продукта. Рекомендуется использовать экструдированную полую полистироловую (ПС) трубку или полипропиленовую (ПП) трубку для литья под давлением в качестве материала для ручки тампона. Независимо от используемого материала, добавки из альгината кальция добавлять нельзя; деревянные или бамбуковые палочки. Вкратце, тампон для отбора проб должен обеспечивать необходимый объем пробы и объем выделяемого вещества, а выбранные материалы не должны содержать веществ, влияющих на последующие анализы.
2. Растворы для сохранения вирусов: На рынке широко используются два вида растворов для сохранения вирусов: один представляет собой модифицированный раствор для поддержания жизнеспособности вирусов на основе транспортной среды, а другой — модифицированный раствор для лизата, полученного при экстракции нуклеиновых кислот.
Основным компонентом первого раствора является основная культуральная среда Игла (МЕМ) или сбалансированная солевая среда Хэнка, в которую добавлены соли, аминокислоты, витамины, глюкоза и белки, необходимые для выживания вируса. В качестве индикатора и раствора используется фенол красный натриевая соль. При значении pH 6,6-8,0 раствор приобретает розовый цвет. В консервирующий раствор добавляют необходимые глюкозу, L-глутамин и белок. Белок обеспечивается в виде фетальной бычьей сыворотки или бычьего сывороточного альбумина, которые могут стабилизировать белковую оболочку вируса. Поскольку консервирующий раствор богат питательными веществами, он способствует выживанию вируса, а также благоприятствует росту бактерий. Если консервирующий раствор загрязнен бактериями, они начнут размножаться в больших количествах. Углекислый газ в их метаболитах вызовет падение pH консервирующего раствора с розового на желтый. Поэтому большинство производителей добавляют в свои составы антибактериальные ингредиенты. Рекомендуемые антибактериальные средства: пенициллин, стрептомицин, гентамицин и полимиксин B. Азид натрия и 2-метил-2-метил-2-метил-2-метил-4-изотиазолин-3-он (MCI) не рекомендуются. Ингибиторы, такие как 4-метил-4-изотиазолин-3-он (MCI) и 5-хлор-2-метил-4-изотиазолин-3-он (CMCI), не рекомендуются, поскольку эти компоненты влияют на ПЦР-реакцию. Поскольку образец, полученный с помощью этого консервирующего раствора, представляет собой, по сути, живой вирус, его подлинность может быть сохранена в максимальной степени, и его можно использовать не только для экстракции и обнаружения вирусных нуклеиновых кислот, но и для культивирования и выделения вирусов. Однако следует отметить, что при использовании для обнаружения экстракцию и очистку нуклеиновых кислот необходимо проводить после инактивации.
Другой вид консервирующего раствора готовится на основе лизата, полученного в результате экстракции нуклеиновых кислот. Основные компоненты включают сбалансированные соли, хелатирующий агент ЭДТА, гуанидиновые соли (например, изотиоцианат гуанидина, гидрохлорид гуанидина и др.), анионные поверхностно-активные вещества (например, додекан сульфат натрия), катионные поверхностно-активные вещества (например, оксалат тетрадецилтриметиламмония), фенол, 8-гидроксихинолин, дитиотреитол (ДТТ), протеиназу К и другие компоненты. Этот раствор для хранения непосредственно расщепляет вирус, высвобождая нуклеиновую кислоту и устраняя РНКазу. Если использовать его только для ОТ-ПЦР, он более подходит, но лизат может инактивировать вирус. Такой образец нельзя использовать для выделения вирусных культур.
В качестве хелатирующего агента для ионов металлов в растворе для консервации вирусов рекомендуется использовать соли ЭДТА (например, дикалийэтилендиаминтетрауксусную кислоту, динатрийэтилендиаминтетрауксусную кислоту и др.), а также не рекомендуется использовать гепарин (например, гепарин натрия, гепарин лития), чтобы не повлиять на результаты ПЦР-анализа.
3. Пробирка для хранения: Материал пробирки для хранения следует выбирать тщательно. Имеются данные, свидетельствующие о том, что полипропилен (полипропилен) способствует адсорбции нуклеиновых кислот, особенно при высокой концентрации ионов, поэтому полиэтилен (полиэтилен) предпочтительнее полипропилена, поскольку он облегчает захват ДНК/РНК. Полиэтиленпропиленовый полимер (полиалломер) и некоторые специально обработанные полипропиленовые контейнеры лучше подходят для хранения ДНК/РНК. Кроме того, при использовании хрупкого тампона следует выбирать контейнер высотой более 8 см, чтобы предотвратить разбрызгивание содержимого и его загрязнение при поломке тампона.
4. Вода для консервирующего раствора: Сверхчистая вода, используемая для консервирующего раствора, должна быть отфильтрована через ультрафильтрационную мембрану с молекулярной массой 13 000 для обеспечения удаления полимерных примесей биологического происхождения, таких как РНКаза, ДНКаза и эндотоксин; обычная очистка не рекомендуется.
2. Использование пробирок для отбора проб вирусов.
Отбор проб с использованием пробирок для взятия вирусных образцов в основном делится на отбор проб из ротоглотки и отбор проб из носоглотки:
1. Взятие образца из ротоглотки: Сначала прижмите язык шпателем, затем опустите головку тампона в горло и протрите миндалины с обеих сторон и заднюю стенку глотки, слегка надавливая на заднюю стенку глотки, избегая касания языка.
2. Назофарингеальный забор образцов: измерьте расстояние от кончика носа до мочки уха с помощью тампона и отметьте пальцем, введите тампон в носовую полость в направлении вертикального положения носа (лица), тампон должен доходить как минимум до половины длины мочки уха до кончика носа. Оставьте тампон в носу на 15-30 секунд, осторожно поверните 3-5 раз и извлеките тампон.
Нетрудно понять по способу использования, будь то мазок из ротоглотки или из носоглотки, что взятие образца — это сложная техническая задача, сопряженная с риском загрязнения. Качество собранного образца напрямую влияет на последующее исследование. Если вирусная нагрузка в собранном образце низкая, легко получить ложноотрицательные результаты, что затрудняет подтверждение диагноза.
Дата публикации: 21 июня 2020 г.
