Algumas considerações sobre o tubo de coleta de amostras de vírus

1. Sobre a fabricação de tubos para coleta de amostras de vírus
Os tubos para coleta de amostras virais pertencem à categoria de dispositivos médicos. A maioria dos fabricantes nacionais possui registro de acordo com a primeira classe de produtos, e poucas empresas possuem registro de acordo com a segunda classe. Recentemente, para atender às necessidades emergenciais de Wuhan e outras localidades, muitas empresas recorreram ao "canal de emergência" para obter a permissão de registro de primeira classe. O tubo para coleta de amostras virais é composto por um swab para coleta, solução de preservação viral e embalagem externa. Como não existe um padrão nacional ou setorial unificado, os produtos de diferentes fabricantes variam bastante.

1. Esfregaço de coleta: O esfregaço de coleta entra em contato direto com o local da amostra, e o material da sua ponta está intimamente relacionado à detecção subsequente. A ponta do esfregaço deve ser feita de fibra sintética de poliéster (PE) ou rayon (fibra artificial). Esfregaços de esponja de alginato de cálcio ou de madeira (incluindo bambu) não devem ser usados, e o material da ponta do esfregaço não pode ser algodão. Isso porque a fibra de algodão tem forte capacidade de adsorção de proteínas, dificultando sua liberação na solução de armazenamento subsequente; além disso, quando um palito de madeira ou bambu contendo alginato de cálcio e componentes de madeira se quebra, a imersão na solução de armazenamento também adsorve proteínas, podendo inclusive inibir a reação de PCR subsequente. Recomenda-se o uso de fibras sintéticas, como fibra de PE, fibra de poliéster e fibra de polipropileno, para o material da ponta do esfregaço. Fibras naturais, como algodão, não são recomendadas. Fibras de náilon também não são recomendadas, pois absorvem água (semelhante às cabeças de escova de dentes). A má qualidade da amostra resulta em volume insuficiente, afetando a taxa de detecção. A esponja de alginato de cálcio é proibida como material para swabs de amostragem! O cabo do swab pode ser de dois tipos: destacável e embutido. No swab destacável, a amostra é colocada no tubo de armazenamento após a coleta, e a tampa do tubo é quebrada a partir da posição próxima à ponta de amostragem; no swab embutido, a amostra é colocada diretamente no tubo de armazenamento após a coleta, e a tampa do tubo é encaixada alinhando o pequeno orifício com a parte superior do cabo e apertando a tampa do tubo. Comparando os dois métodos, o segundo é relativamente mais seguro. Quando o swab destacável é usado em conjunto com um tubo de armazenamento de tamanho menor, pode ocorrer respingo de líquido no tubo ao ser quebrado, e deve-se ter muita atenção ao risco de contaminação causado pelo uso inadequado do produto. Recomenda-se o uso de tubo extrudado de poliestireno (PS) oco ou tubo injetado de polipropileno (PP) para o cabo do swab. Independentemente do material utilizado, não é permitida a adição de alginato de cálcio. Varetas de madeira ou de bambu. Em resumo, o cotonete de coleta deve garantir a quantidade de amostra e a quantidade liberada, e os materiais selecionados não devem conter substâncias que possam afetar os testes subsequentes.

2. Solução de preservação de vírus: Existem dois tipos de soluções de preservação de vírus amplamente utilizadas no mercado: uma é uma solução de manutenção viral modificada com base no meio de transporte, e a outra é uma solução modificada para lisado de extração de ácido nucleico.
O principal componente da solução de preservação é o meio de cultura básico de Eagle (MEM) ou a solução salina balanceada de Hank, à qual são adicionados os sais, aminoácidos, vitaminas, glicose e proteínas necessários para a sobrevivência do vírus. Essa solução de preservação utiliza o sal sódico do vermelho de fenol como indicador e solubilizador. Quando o pH está entre 6,6 e 8,0, a solução apresenta coloração rosa. A glicose, a L-glutamina e a proteína necessárias são adicionadas à solução de preservação. A proteína é fornecida na forma de soro fetal bovino ou albumina sérica bovina, que estabilizam a cápsula proteica do vírus. Por ser rica em nutrientes, a solução de preservação não só favorece a sobrevivência do vírus, como também o crescimento de bactérias. Se a solução de preservação for contaminada por bactérias, estas se multiplicarão em grande quantidade. O dióxido de carbono presente em seus metabólitos fará com que o pH da solução de preservação mude de rosa para amarelo. Portanto, a maioria dos fabricantes adiciona ingredientes antibacterianos às suas formulações. Os agentes antibacterianos recomendados são penicilina, estreptomicina, gentamicina e polimixina B. Azida sódica e 2-metil-4-isotiazolin-3-ona (MCI) e 5-cloro-2-metil-4-isotiazolin-3-ona (CMCI) não são recomendados, pois esses componentes afetam a reação de PCR. Como a amostra fornecida por esta solução de preservação é basicamente um vírus vivo, a originalidade da amostra pode ser mantida ao máximo, podendo ser utilizada não apenas para a extração e detecção de ácidos nucleicos virais, mas também para o cultivo e isolamento de vírus. No entanto, deve-se observar que, quando utilizada para detecção, a extração e purificação do ácido nucleico devem ser realizadas após a inativação.
Outro tipo de solução de preservação é preparada a partir do lisado de extração de ácido nucleico. Seus principais componentes são sais balanceados, o agente quelante EDTA, sais de guanidina (como isotiocianato de guanidina, cloridrato de guanidina, etc.), surfactantes aniônicos (como dodecano e sulfato de sódio), surfactantes catiônicos (como oxalato de tetradeciltrimetilamônio), fenol, 8-hidroxiquinolina, ditiotreitol (DTT), proteinase K e outros componentes. Essa solução de preservação tem como objetivo clivar diretamente o vírus para liberar o ácido nucleico e eliminar a RNase. Se utilizada apenas para RT-PCR, é mais adequada, mas o lisado pode inativar o vírus. Esse tipo de amostra não pode ser usado para separação de culturas virais.

Recomenda-se o uso de sais de EDTA (como ácido etilenodiaminotetracético dipotássico, ácido etilenodiaminotetracético dissódico, etc.) como agente quelante de íons metálicos na solução de preservação do vírus, e não se recomenda o uso de heparina (como heparina sódica, heparina de lítio), para não afetar a detecção por PCR.
3. Tubo de preservação: O material do tubo de preservação deve ser cuidadosamente selecionado. Existem dados que sugerem que o polipropileno (Polipropileno) está relacionado à adsorção de ácido nucleico, especialmente em alta concentração iônica. O polietileno (Polietileno) é mais indicado para facilitar a coleta de DNA/RNA. Recipientes de plástico de polímero de polietileno-propileno (Polialômero) e alguns recipientes de plástico de polipropileno com processamento especial são mais adequados para o armazenamento de DNA/RNA. Além disso, ao usar um swab quebrável, o tubo de armazenamento deve ter altura superior a 8 cm para evitar que o conteúdo se espalhe e contamine o swab caso ele se quebre.

4. Água para solução de preservação na produção: A água ultrapura utilizada para a solução de preservação na produção deve ser filtrada através de uma membrana de ultrafiltração com peso molecular de 13.000 para garantir a remoção de impurezas poliméricas de origem biológica, como RNase, DNase e endotoxinas. A purificação comum ou água destilada não é recomendada.

2. Utilização de tubos de coleta de amostras virais

A coleta de amostras utilizando o tubo de coleta viral divide-se principalmente em coleta orofaríngea e coleta nasofaríngea:

1. Coleta de amostra orofaríngea: Primeiro, pressione a língua com o abaixador de língua e, em seguida, estenda a ponta do swab de coleta na garganta para limpar as amígdalas faríngeas bilaterais e a parede posterior da faringe. Limpe a parede posterior da faringe com leve pressão, evitando tocar a língua.

2. Coleta de amostra nasofaríngea: meça a distância da ponta do nariz até o lóbulo da orelha com um cotonete e marque com o dedo. Insira o cotonete na cavidade nasal na direção vertical do nariz (face). O cotonete deve se estender por pelo menos metade do comprimento do lóbulo da orelha até a ponta do nariz. Deixe o cotonete no nariz por 15 a 30 segundos, gire-o suavemente de 3 a 5 vezes e retire-o.
Não é difícil perceber, pelo método de coleta, seja por swab orofaríngeo ou nasofaríngeo, que a amostragem é uma tarefa técnica, complexa e sujeita a contaminação. A qualidade da amostra coletada está diretamente relacionada à detecção subsequente. Se a amostra coletada apresentar baixa carga viral, é fácil obter resultados falso-negativos, dificultando a confirmação do diagnóstico.