1. Informazioni sulla fabbricazione delle provette per il campionamento del virus
Le provette per il campionamento del virus appartengono ai dispositivi medici. La maggior parte dei produttori nazionali è registrata come prodotto di prima classe, mentre poche aziende sono registrate come prodotto di seconda classe. Recentemente, per far fronte alle esigenze di emergenza di Wuhan e di altri luoghi, molte aziende hanno adottato il "canale di emergenza" "Richiedi l'autorizzazione di registrazione di prima classe". La provetta per il campionamento del virus è composta da un tampone di campionamento, una soluzione di conservazione del virus e un imballaggio esterno. Poiché non esiste uno standard nazionale o di settore unificato, i prodotti dei vari produttori variano notevolmente.
1. Tampone di campionamento: il tampone di campionamento entra in contatto diretto con il sito di campionamento e il materiale della testa di campionamento è strettamente correlato al successivo rilevamento. La testa del tampone di campionamento deve essere realizzata in fibra sintetica di poliestere (PE) o rayon (fibra artificiale). Non è possibile utilizzare tamponi in spugna di alginato di calcio o bastoncini di legno (inclusi i bastoncini di bambù) e il materiale della testa del tampone non può essere di cotone. Poiché la fibra di cotone ha un forte assorbimento di proteine, non è facile eluirla nella successiva soluzione di conservazione; e quando un bastoncino di legno o di bambù contenente alginato di calcio e componenti in legno si rompe, l'immersione nella soluzione di conservazione assorbirà anche le proteine e potrebbe persino inibire la successiva reazione di PCR. Si consiglia di utilizzare fibre sintetiche come fibra di PE, fibra di poliestere e fibra di polipropilene per il materiale della testa del tampone. Le fibre naturali come il cotone non sono raccomandate. Anche le fibre di nylon non sono raccomandate perché le fibre di nylon (simili alle testine degli spazzolini da denti) assorbono acqua. Scarsa, con conseguente volume di campionamento insufficiente, che influisce sul tasso di rilevamento. La spugna di alginato di calcio è vietata per il campionamento del materiale del tampone! L'impugnatura del tampone è di due tipi: rotta e incorporata. Il tampone rotto viene inserito nella provetta di conservazione dopo il campionamento e il tappo della provetta viene rotto dopo essere stato rimosso dalla posizione vicino alla testa di campionamento; il tampone incorporato inserisce direttamente il tampone di campionamento nella provetta di conservazione dopo il campionamento e il tappo della provetta di conservazione è incorporato. Allineare il piccolo foro con la parte superiore dell'impugnatura e serrare il tappo della provetta. Confrontando i due metodi, quest'ultimo è relativamente sicuro. Quando il tampone rotto viene utilizzato insieme a una provetta di conservazione di dimensioni inferiori, potrebbe causare schizzi di liquido nella provetta in caso di rottura, pertanto è necessario prestare la massima attenzione al rischio di contaminazione causato da un uso improprio del prodotto. Si consiglia di utilizzare un tubo estruso cavo in polistirene (PS) o un tubo per cordonatura a iniezione in polipropilene (PP) come materiale dell'impugnatura del tampone. Indipendentemente dal materiale utilizzato, non è possibile aggiungere additivi a base di alginato di calcio; bastoncini di legno o bastoncini di bambù. In breve, il tampone di campionamento deve garantire la quantità di campionamento e la quantità di rilascio, e i materiali selezionati non devono contenere sostanze che possano influenzare i test successivi.
2. Soluzione di conservazione del virus: sul mercato sono ampiamente utilizzate due tipologie di soluzioni di conservazione del virus: una è una soluzione di mantenimento del virus modificata in base al mezzo di trasporto, e l'altra è una soluzione modificata per il lisato di estrazione dell'acido nucleico.
Il componente principale del primo è il terreno di coltura basico di Eagle (MEM) o il sale bilanciato di Hank, a cui vengono aggiunti sali, amminoacidi, vitamine, glucosio e proteine necessari per la sopravvivenza del virus. Questa soluzione di conservazione utilizza il sale sodico di rosso fenolo come indicatore e soluzione. Quando il valore del pH è compreso tra 6,6 e 8,0, la soluzione è rosa. Il glucosio, la L-glutammina e le proteine necessari vengono aggiunti alla soluzione di conservazione. Le proteine sono fornite sotto forma di siero fetale bovino o albumina sierica bovina, che può stabilizzare l'involucro proteico del virus. Poiché la soluzione di conservazione è ricca di nutrienti, è favorevole alla sopravvivenza del virus ma anche alla crescita dei batteri. Se la soluzione di conservazione è contaminata da batteri, questi si moltiplicheranno in grandi quantità. L'anidride carbonica nei suoi metaboliti farà sì che il pH della soluzione di conservazione passi dal rosa al giallo. Pertanto, la maggior parte dei produttori ha aggiunto ingredienti antibatterici alle proprie formulazioni. Gli agenti antibatterici raccomandati sono penicillina, streptomicina, gentamicina e polimixina B. Sodio azide e 2-metil sono sconsigliati. Inibitori come 4-metil-4-isotiazol-3-one (MCI) e 5-cloro-2-metil-4-isotiazol-3-one (CMCI) non sono raccomandati perché influenzano la reazione di PCR. Poiché il campione fornito da questa soluzione di conservazione è fondamentalmente un virus vivo, l'originalità del campione può essere preservata al massimo e può essere utilizzato non solo per l'estrazione e il rilevamento degli acidi nucleici virali, ma anche per la coltivazione e l'isolamento dei virus. Tuttavia, è opportuno notare che, quando utilizzato per il rilevamento, l'estrazione e la purificazione degli acidi nucleici devono essere eseguite dopo l'inattivazione.
Un altro tipo di soluzione di conservazione preparata a base di lisato di estrazione di acidi nucleici, i cui componenti principali sono sali bilanciati, agente chelante EDTA, sale di guanidina (come isotiocianato di guanidina, cloridrato di guanidina, ecc.), tensioattivo anionico (come dodecano solfato di sodio), tensioattivi cationici (come ossalato di tetradeciltrimetilammonio), fenolo, 8-idrossichinolina, ditiotreitolo (DTT), proteinasi K e altri componenti. Questa soluzione di conservazione serve a scindere direttamente il virus per rilasciare l'acido nucleico ed eliminare la RNasi. Se utilizzata solo per RT-PCR, è più adatta, ma il lisato può inattivare il virus. Questo tipo di campione non può essere utilizzato per la separazione delle colture virali.
Si consiglia di utilizzare come agente chelante ionico metallico nella soluzione di conservazione del virus sali di EDTA (come acido etilendiamminotetraacetico dipotassico, acido etilendiamminotetraacetico disodico, ecc.) e di non utilizzare eparina (come eparina sodica, eparina di litio), per non compromettere il rilevamento tramite PCR.
3. Provetta di conservazione: il materiale della provetta di conservazione deve essere selezionato con cura. Esistono dati che suggeriscono che il polipropilene (polipropilene) è correlato all'adsorbimento dell'acido nucleico, soprattutto ad alta concentrazione di ioni di tensione; il polietilene (polietilene) è più preferito del polipropilene (polipropilene). DNA/RNA facile da afferrare. La plastica polimerica in polietilene-propilene (poliallomero) e alcuni contenitori in polipropilene (polipropilene) appositamente lavorati sono più adatti per la conservazione di DNA/RNA. Inoltre, quando si utilizza un tampone fragile, la provetta di conservazione dovrebbe essere selezionata con un'altezza superiore a 8 cm per evitare che il contenuto venga schizzato e contaminato quando il tampone viene rotto.
4. Acqua per la soluzione di conservazione della produzione: l'acqua ultrapura utilizzata per la soluzione di conservazione della produzione deve essere filtrata attraverso una membrana di ultrafiltrazione con un peso molecolare di 13.000 per garantire la rimozione delle impurità polimeriche da fonti biologiche, come RNasi, DNasi ed endotossine; la purificazione ordinaria non è raccomandata. Acqua o acqua distillata.
2. Utilizzo di provette per il campionamento del virus
Il campionamento mediante la provetta per il campionamento del virus si divide principalmente in campionamento orofaringeo e campionamento nasofaringeo:
1. Campionamento orofaringeo: premere prima la lingua con l'abbassalingua, quindi estendere la testa del tampone di campionamento nella gola per pulire le tonsille faringee bilaterali e la parete faringea posteriore e pulire la parete faringea posteriore con una leggera forza, evitando di toccare l'unità linguale.
2. Campionamento nasofaringeo: misurare la distanza dalla punta del naso al lobo dell'orecchio con un tampone e segnare con un dito, inserire il tampone di campionamento nella cavità nasale nella direzione del naso verticale (viso), il tampone deve estendersi almeno per metà della lunghezza del lobo dell'orecchio fino alla punta del naso, lasciare il tampone nel naso per 15-30 secondi, ruotare delicatamente 3-5 volte ed estrarre il tampone.
Non è difficile capire dal metodo di utilizzo, che si tratti di un tampone orofaringeo o di un tampone nasofaringeo, che il campionamento è un'operazione tecnica, difficile e contaminata. La qualità del campione raccolto è direttamente correlata alla successiva rilevazione. Se il campione raccolto ha una carica virale bassa, è facile che si verifichino falsi negativi, rendendo difficile confermare la diagnosi.
Data di pubblicazione: 21-06-2020
