Quelques réflexions sur les tubes de prélèvement de virus

1. À propos de la fabrication des tubes de prélèvement de virus
Les tubes de prélèvement de virus sont des dispositifs médicaux. La plupart des fabricants nationaux sont enregistrés en tant que produits de première classe, et quelques-uns en tant que produits de deuxième classe. Récemment, afin de répondre aux besoins urgents à Wuhan et ailleurs, de nombreuses entreprises ont utilisé la procédure d'urgence pour obtenir l'autorisation d'enregistrement en première classe. Un tube de prélèvement de virus se compose d'un écouvillon, d'une solution de conservation du virus et d'un emballage extérieur. En l'absence de norme nationale ou sectorielle unifiée, les produits des différents fabricants présentent de grandes variations.

1. Écouvillon de prélèvement : L'écouvillon de prélèvement est en contact direct avec le site de prélèvement, et le matériau de son embout est essentiel pour la détection ultérieure. L'embout doit être en polyester (PE) ou en rayonne (fibre synthétique). Les écouvillons en éponge d'alginate de calcium ou en bâtonnet de bois (y compris en bambou) sont à proscrire, de même que le coton. En effet, le coton adsorbe fortement les protéines, ce qui peut entraver leur élution dans la solution de conservation. De plus, un bâtonnet de bois ou de bambou contenant de l'alginate de calcium et des composants ligneux, s'il se casse et est imbibé de la solution de conservation, adsorbera également des protéines, pouvant même inhiber la réaction PCR ultérieure. Il est recommandé d'utiliser des fibres synthétiques telles que le PE, le polyester ou le polypropylène pour l'embout. Les fibres naturelles comme le coton sont déconseillées. Les fibres de nylon sont également à proscrire car, comme les têtes de brosse à dents, elles absorbent mal l'eau, ce qui réduit le volume de prélèvement et affecte le taux de détection. L'utilisation d'éponges en alginate de calcium est interdite pour les écouvillons de prélèvement ! Il existe deux types de manches d'écouvillon : à ouverture partielle et à ouverture totale. Avec un écouvillon à ouverture partielle, placez-le dans le tube de stockage après le prélèvement, puis cassez le bouchon du tube près de l'extrémité de l'écouvillon. Avec un écouvillon à ouverture totale, insérez directement l'écouvillon dans le tube de stockage après le prélèvement, puis refermez le tube en alignant le petit orifice avec le haut du manche. La méthode à ouverture totale est plus sûre. L'utilisation d'un écouvillon à ouverture partielle avec un tube de stockage de petite taille peut entraîner des projections de liquide lors de l'ouverture du tube ; il convient donc d'être vigilant quant au risque de contamination lié à une mauvaise utilisation du produit. Il est recommandé d'utiliser un tube extrudé en polystyrène creux (PS) ou un tube en polypropylène (PP) moulé par injection pour la fabrication du manche. Quel que soit le matériau utilisé, l'ajout d'alginate de calcium, de bâtonnets en bois ou en bambou est proscrit. En résumé, l'écouvillon de prélèvement doit garantir la quantité d'échantillon prélevée et la quantité de produit rejeté, et les matériaux sélectionnés ne doivent pas contenir de substances susceptibles d'affecter les tests ultérieurs.

2. Solution de conservation des virus : Il existe deux types de solutions de conservation des virus largement utilisés sur le marché : une solution de conservation des virus modifiée en fonction du milieu de transport et une solution modifiée pour le lysat d'extraction d'acides nucléiques.
Le principal composant de la solution de conservation est le milieu de culture de base d'Eagle (MEM) ou le milieu salin équilibré de Hank, auquel sont ajoutés les sels, acides aminés, vitamines, glucose et protéines nécessaires à la survie du virus. Cette solution utilise le rouge de phénol sodique comme indicateur. Lorsque le pH se situe entre 6,6 et 8,0, la solution est rose. Le glucose, la L-glutamine et les protéines nécessaires sont ajoutés à la solution de conservation. Les protéines sont fournies sous forme de sérum de veau fœtal ou d'albumine de sérum bovin, ce qui permet de stabiliser la capside virale. La richesse de la solution en nutriments favorise la survie du virus, mais aussi la croissance bactérienne. En cas de contamination bactérienne, les bactéries se multiplient rapidement. Le dioxyde de carbone issu de leurs métabolites entraîne une chute du pH de la solution, qui passe du rose au jaune. C'est pourquoi la plupart des fabricants ajoutent des agents antibactériens à leurs formulations. Les agents antibactériens recommandés sont la pénicilline, la streptomycine, la gentamicine et la polymyxine B. L'azide de sodium et le 2-méthyl-isothiazolin-3-one (MCI) et le 5-chloro-2-méthyl-4-isothiazolin-3-one (CMCI) sont déconseillés car ils peuvent interférer avec la réaction PCR. L'échantillon conservé dans cette solution étant un virus vivant, son intégrité est préservée au maximum. Il peut être utilisé pour l'extraction et la détection des acides nucléiques viraux, ainsi que pour la culture et l'isolement des virus. Toutefois, il est important de noter que, pour la détection, l'extraction et la purification des acides nucléiques doivent être effectuées après inactivation.
Une autre solution de conservation, préparée à partir d'un lysat d'extraction d'acide nucléique, est principalement composée de sels minéraux, d'EDTA (agent chélateur), d'un sel de guanidine (tel que l'isothiocyanate de guanidine ou le chlorhydrate de guanidine), d'un tensioactif anionique (tel que le sulfate de dodécane sodique), d'un tensioactif cationique (tel que l'oxalate de tétradécyltriméthylammonium), de phénol, de 8-hydroxyquinoléine, de dithiothréitol (DTT), de protéinase K et d'autres composants. Cette solution permet de cliver directement le virus pour libérer l'acide nucléique et éliminer la RNase. Elle est particulièrement adaptée à la RT-PCR, mais le lysat peut inactiver le virus. Ce type d'échantillon ne convient pas à la séparation des cultures virales.

L'agent chélateur d'ions métalliques utilisé dans la solution de conservation du virus est recommandé d'utiliser des sels d'EDTA (tels que l'acide éthylènediaminetétraacétique dipotassique, l'acide éthylènediaminetétraacétique disodique, etc.), et il n'est pas recommandé d'utiliser de l'héparine (telle que l'héparine sodique, l'héparine de lithium), afin de ne pas affecter la détection par PCR.
3. Tube de conservation : Le matériau du tube de conservation doit être choisi avec soin. Des données suggèrent que le polypropylène (PP) favorise l’adsorption des acides nucléiques, notamment à forte concentration ionique. Le polyéthylène (PE) est préférable au PP pour une meilleure rétention de l’ADN/ARN. Les récipients en polyéthylène-propylène (polyallomère) et certains récipients en polypropylène (PP) spécialement traités sont plus adaptés à la conservation de l’ADN/ARN. De plus, lors de l’utilisation d’un écouvillon cassable, il est recommandé de choisir un tube de conservation d’une hauteur supérieure à 8 cm afin d’éviter les projections et la contamination du contenu en cas de bris de l’écouvillon.

4. Eau pour la solution de conservation : L’eau ultrapure utilisée pour la solution de conservation doit être filtrée à travers une membrane d’ultrafiltration de 13 000 Da afin d’éliminer les impuretés polymères d’origine biologique, telles que la RNase, la DNase et les endotoxines. L’utilisation d’eau purifiée ordinaire ou d’eau distillée est déconseillée.

2. Utilisation de tubes de prélèvement de virus

Le prélèvement d'échantillons à l'aide du tube de prélèvement viral se divise principalement en prélèvement oropharyngé et prélèvement nasopharyngé :

1. Prélèvement oropharyngé : Commencez par appuyer sur la langue avec l’abaisse-langue, puis étendez la tête de l’écouvillon de prélèvement dans la gorge pour essuyer les amygdales pharyngées bilatérales et la paroi pharyngée postérieure, et essuyez la paroi pharyngée postérieure avec une légère pression, en évitant de toucher la langue.

2. Prélèvement nasopharyngé : mesurer la distance entre le bout du nez et le lobe de l’oreille à l’aide d’un écouvillon et la marquer avec un doigt, insérer l’écouvillon dans la cavité nasale en suivant la direction verticale du nez (visage), l’écouvillon devant s’étendre au moins sur la moitié de la longueur du lobe de l’oreille jusqu’au bout du nez, laisser l’écouvillon dans le nez pendant 15 à 30 secondes, effectuer 3 à 5 rotations douces et retirer l’écouvillon.
Il est facile de constater, d'après la méthode d'utilisation (écouvillon oropharyngé ou nasopharyngé), que le prélèvement est une opération technique délicate et sujette à contamination. La qualité de l'échantillon prélevé influe directement sur le résultat de l'analyse. Un échantillon présentant une faible charge virale risque d'entraîner des faux négatifs et de compromettre le diagnostic.