1. À propos de la fabrication des tubes d'échantillonnage de virus
Les tubes de prélèvement de virus font partie des dispositifs médicaux. La plupart des fabricants nationaux sont enregistrés comme produits de première classe, tandis que peu d'entreprises sont enregistrées comme produits de deuxième classe. Récemment, afin de répondre aux besoins urgents de Wuhan et d'autres villes, de nombreuses entreprises ont adopté la procédure d'urgence : « Demander une autorisation d'enregistrement de première classe ». Le tube de prélèvement de virus est composé d'un écouvillon, d'une solution de conservation du virus et d'un emballage extérieur. En l'absence de norme nationale unifiée ou de norme industrielle, les produits des différents fabricants sont très différents.
1. Écouvillon de prélèvement : L'écouvillon est en contact direct avec le site de prélèvement, et le matériau de la tête de prélèvement est étroitement lié à la détection ultérieure. La tête de l'écouvillon doit être en fibre synthétique de polyester (PE) ou en rayonne (fibre synthétique). Les écouvillons en éponge d'alginate de calcium ou en bâtonnet de bois (y compris les bâtonnets de bambou) ne peuvent pas être utilisés, et la tête de l'écouvillon ne doit pas être en coton. La fibre de coton ayant une forte capacité d'absorption des protéines, elle est difficile à éluer dans la solution de stockage ultérieure. De plus, si un bâtonnet de bois ou de bambou contenant de l'alginate de calcium et des composants en bois est brisé, le trempage dans la solution de stockage adsorbera également les protéines et peut même inhiber la réaction PCR ultérieure. Il est recommandé d'utiliser des fibres synthétiques telles que le PE, le polyester et le polypropylène pour la tête de l'écouvillon. Les fibres naturelles comme le coton sont déconseillées. Les fibres de nylon sont également déconseillées, car elles (comme les têtes de brosse à dents) absorbent l'eau. Faible, ce qui entraîne un volume d'échantillonnage insuffisant et affecte le taux de détection. L'utilisation d'une éponge d'alginate de calcium est interdite pour l'échantillonnage des écouvillons ! Il existe deux types de manche d'écouvillon : cassé et intégré. L'écouvillon cassé est placé dans le tube de stockage après l'échantillonnage, et le bouchon du tube est cassé après avoir été cassé près de la tête d'échantillonnage ; l'écouvillon intégré est placé directement dans le tube de stockage après l'échantillonnage, et le couvercle du tube de stockage est intégré. Alignez le petit trou avec le haut du manche et serrez le couvercle du tube. Comparativement aux deux méthodes, la seconde est relativement sûre. L'utilisation d'un écouvillon cassé avec un tube de stockage plus petit peut provoquer des éclaboussures de liquide dans le tube. Une attention particulière doit être portée au risque de contamination dû à une mauvaise utilisation du produit. Il est recommandé d'utiliser un tube extrudé creux en polystyrène (PS) ou un tube de pliage par injection en polypropylène (PP) pour le manche de l'écouvillon. Quel que soit le matériau utilisé, l'ajout d'alginate de calcium (bâtonnets de bois ou de bambou) est interdit. En bref, l’écouvillon d’échantillonnage doit garantir la quantité d’échantillonnage et la quantité de rejet, et les matériaux sélectionnés ne doivent pas contenir de substances qui affectent les tests ultérieurs.
2. Solution de préservation du virus : Il existe deux types de solutions de préservation du virus largement utilisées sur le marché, l'une est une solution de maintenance du virus modifiée en fonction du milieu de transport, et l'autre est une solution modifiée pour le lysat d'extraction d'acide nucléique.
Le composant principal de la première est le milieu de culture basique d'Eagle (MEM) ou le sel équilibré de Hank, auquel sont ajoutés les sels, acides aminés, vitamines, glucose et protéines nécessaires à la survie du virus. Cette solution de conservation utilise du sel de sodium de rouge de phénol comme indicateur et solution. Lorsque le pH est compris entre 6,6 et 8,0, la solution est rose. Le glucose, la L-glutamine et les protéines nécessaires sont ajoutés à la solution de conservation. Les protéines sont fournies sous forme de sérum fœtal bovin ou d'albumine sérique bovine, qui peuvent stabiliser l'enveloppe protéique du virus. Riche en nutriments, la solution de conservation favorise la survie du virus, mais aussi la croissance bactérienne. Si la solution de conservation est contaminée par des bactéries, celles-ci se multiplient en grande quantité. Le dioxyde de carbone contenu dans ses métabolites fait passer le pH de la solution de conservation du rose au jaune. C'est pourquoi la plupart des fabricants ajoutent des ingrédients antibactériens à leurs formulations. Les agents antibactériens recommandés sont la pénicilline, la streptomycine, la gentamicine et la polymyxine B. L'azoture de sodium et le 2-méthyl inhibiteurs tels que la 4-méthyl-4-isothiazolin-3-one (MCI) et la 5-chloro-2-méthyl-4-isothiazolin-3-one (CMCI) ne sont pas recommandés, car ces composants ont un effet sur la réaction de PCR. L'échantillon fourni par cette solution de conservation étant essentiellement un virus vivant, son originalité peut être préservée au maximum et il peut être utilisé non seulement pour l'extraction et la détection des acides nucléiques viraux, mais aussi pour la culture et l'isolement des virus. Cependant, il convient de noter que lors de l'utilisation pour la détection, l'extraction et la purification des acides nucléiques doivent être effectuées après inactivation.
Un autre type de solution de conservation préparée à partir d'un lysat d'extraction d'acide nucléique est le lysat. Ses principaux composants sont des sels équilibrés, un agent chélateur EDTA, un sel de guanidine (tel que l'isothiocyanate de guanidine, le chlorhydrate de guanidine, etc.), un tensioactif anionique (tel que le sulfate de dodécane sodique), des tensioactifs cationiques (tels que l'oxalate de tétradécyltriméthylammonium), du phénol, de la 8-hydroxyquinoléine, du dithiothréitol (DTT), de la protéinase K et d'autres composants. Cette solution de conservation clive directement le virus pour libérer l'acide nucléique et éliminer la RNase. Si elle est utilisée uniquement pour la RT-PCR, elle est plus adaptée, mais le lysat peut inactiver le virus. Ce type d'échantillon ne peut pas être utilisé pour la séparation des cultures virales.
Il est recommandé d'utiliser des sels EDTA (tels que l'acide éthylènediaminetétraacétique dipotassique, l'acide éthylènediaminetétraacétique disodique, etc.) comme agent chélateur d'ions métalliques utilisé dans la solution de conservation du virus, et il n'est pas recommandé d'utiliser de l'héparine (comme l'héparine de sodium, l'héparine de lithium), afin de ne pas affecter la détection par PCR.
3. Tube de conservation : Le matériau du tube de conservation doit être choisi avec soin. Des données suggèrent que le polypropylène est lié à l'adsorption des acides nucléiques, en particulier à forte concentration d'ions de tension. Le polyéthylène est préférable au polypropylène. L'ADN/ARN est facile à saisir. Le plastique polymère polyéthylène-propylène (polyallomère) et certains contenants en polypropylène (polypropylène) spécialement traités sont plus adaptés au stockage de l'ADN/ARN. De plus, si vous utilisez un écouvillon cassable, privilégiez un contenant d'une hauteur supérieure à 8 cm pour le tube de conservation afin d'éviter les éclaboussures et la contamination du contenu en cas de rupture de l'écouvillon.
4. Eau pour la solution de conservation de production : L'eau ultrapure utilisée pour la solution de conservation de production doit être filtrée à travers une membrane d'ultrafiltration d'un poids moléculaire de 13 000 pour garantir l'élimination des impuretés polymères d'origine biologique, telles que la RNase, la DNase et les endotoxines. Une purification ordinaire n'est pas recommandée. Eau ou eau distillée.
2. Utilisation de tubes d'échantillonnage de virus
L'échantillonnage à l'aide du tube d'échantillonnage de virus est principalement divisé en échantillonnage oropharyngé et échantillonnage nasopharyngé :
1. Échantillonnage oropharyngé : appuyez d'abord sur la langue avec l'abaisse-langue, puis étendez la tête de l'écouvillon d'échantillonnage dans la gorge pour essuyer les amygdales pharyngées bilatérales et la paroi pharyngée postérieure, et essuyez la paroi pharyngée postérieure avec une force légère, en évitant de toucher l'unité de la langue.
2. Échantillonnage nasopharyngé : mesurez la distance entre le bout du nez et le lobe de l'oreille avec un écouvillon et marquez avec un doigt, insérez l'écouvillon d'échantillonnage dans la cavité nasale dans le sens du nez vertical (visage), l'écouvillon doit s'étendre au moins sur la moitié de la longueur du lobe de l'oreille jusqu'au bout du nez, laissez l'écouvillon dans le nez pendant 15 à 30 secondes, faites-le tourner doucement 3 à 5 fois et retirez l'écouvillon.
Il est facile de constater, d'après la méthode d'utilisation, qu'il s'agisse d'un écouvillon oropharyngé ou nasopharyngé, que le prélèvement est une tâche technique complexe et contaminée. La qualité de l'échantillon prélevé est directement liée à la détection ultérieure. Si la charge virale de l'échantillon prélevé est faible, il est facile de produire des faux négatifs et il est difficile de confirmer le diagnostic.
Date de publication : 21 juin 2020
