۱. درباره ساخت لولههای نمونهبرداری ویروس
لولههای نمونهگیری ویروس متعلق به محصولات تجهیزات پزشکی هستند. اکثر تولیدکنندگان داخلی طبق محصولات درجه یک ثبت شدهاند و تعداد کمی از شرکتها طبق محصولات درجه دو ثبت شدهاند. اخیراً، به منظور رفع نیازهای اضطراری ووهان و سایر مناطق، بسیاری از شرکتها "کانال اضطراری" را اتخاذ کردهاند. "برای مجوز ثبت درجه یک درخواست دهید." لوله نمونهگیری ویروس از یک سواب نمونهگیری، محلول نگهداری ویروس و بستهبندی بیرونی تشکیل شده است. از آنجایی که هیچ استاندارد ملی یا استاندارد صنعتی واحدی وجود ندارد، محصولات تولیدکنندگان مختلف بسیار متفاوت است.
۱. سواب نمونهبرداری: سواب نمونهبرداری مستقیماً با محل نمونهبرداری تماس میگیرد و جنس سر نمونهبرداری ارتباط نزدیکی با تشخیص بعدی دارد. سر سواب نمونهبرداری باید از الیاف مصنوعی پلیاستر (PE) یا ریون (الیاف مصنوعی) ساخته شود. نمیتوان از اسفنج آلژینات کلسیم یا سوابهای چوبی (از جمله چوبهای بامبو) استفاده کرد و جنس سر سواب نمیتواند از محصولات پنبهای باشد. از آنجا که الیاف پنبه جذب قوی پروتئین دارند، به راحتی در محلول نگهداری بعدی حل نمیشوند. و هنگامی که یک چوب چوبی یا چوب بامبو حاوی آلژینات کلسیم و اجزای چوبی شکسته شود، خیساندن در محلول نگهداری نیز پروتئین را جذب میکند و حتی میتواند واکنش PCR بعدی را مهار کند. توصیه میشود از الیاف مصنوعی مانند الیاف PE، الیاف پلیاستر و الیاف پلیپروپیلن برای جنس سر سواب استفاده شود. الیاف طبیعی مانند پنبه توصیه نمیشوند. الیاف نایلونی نیز توصیه نمیشوند زیرا الیاف نایلونی (شبیه سر مسواک) آب را جذب میکنند. ضعیف هستند و در نتیجه حجم نمونهگیری کافی نیست و بر میزان تشخیص تأثیر میگذارد. استفاده از اسفنج آلژینات کلسیم برای نمونهبرداری از مواد سواب ممنوع است! دسته سواب دو نوع دارد: شکسته و توکار. سواب شکسته پس از نمونهبرداری در لوله نگهداری قرار میگیرد و درپوش لوله پس از شکسته شدن از موقعیت نزدیک سر نمونهبرداری شکسته میشود. سواب توکار سواب نمونهبرداری را پس از نمونهبرداری مستقیماً در لوله نگهداری قرار میدهد و پوشش لوله لوله نگهداری به صورت توکار است. سوراخ کوچک را با بالای دسته تراز کنید و پوشش لوله را محکم کنید. با مقایسه دو روش، روش دوم نسبتاً ایمن است. هنگامی که سواب شکسته همراه با یک لوله نگهداری با اندازه کوچکتر استفاده میشود، ممکن است هنگام شکستن باعث پاشش مایع در لوله شود و باید به خطر آلودگی ناشی از استفاده نادرست از محصول توجه کامل شود. توصیه میشود از لوله اکسترود شده توخالی پلی استایرن (PS) یا لوله چین دار تزریقی پلی پروپیلن (PP) برای جنس دسته سواب استفاده شود. صرف نظر از اینکه از چه مادهای استفاده میشود، افزودنیهای آلژینات کلسیم را نمیتوان اضافه کرد؛ چوبهای چوبی یا چوبهای بامبو. به طور خلاصه، سواب نمونهبرداری باید میزان نمونهبرداری و میزان آزادسازی را تضمین کند و مواد انتخاب شده نباید حاوی موادی باشند که بر آزمایشهای بعدی تأثیر میگذارند.
۲. محلول حفظ ویروس: دو نوع محلول حفظ ویروس به طور گسترده در بازار استفاده میشود، یکی محلول حفظ ویروس اصلاحشده بر اساس محیط انتقال و دیگری محلول اصلاحشده برای لیزات استخراج اسید نوکلئیک.
جزء اصلی اولی، محیط کشت پایه ایگل (MEM) یا نمک متعادل هنک است که با نمکها، اسیدهای آمینه، ویتامینها، گلوکز و پروتئین لازم برای بقای ویروس اضافه میشود. این محلول نگهداری از نمک سدیم فنل رد به عنوان شاخص و محلول استفاده میکند. وقتی مقدار pH بین ۶.۶ تا ۸.۰ باشد، محلول صورتی رنگ است. گلوکز، ال-گلوتامین و پروتئین لازم به محلول نگهدارنده اضافه میشوند. پروتئین به شکل سرم جنین گاوی یا آلبومین سرم گاوی تهیه میشود که میتواند پوسته پروتئینی ویروس را تثبیت کند. از آنجا که محلول نگهدارنده غنی از مواد مغذی است، برای بقای ویروس مفید است، اما برای رشد باکتریها نیز مفید است. اگر محلول نگهدارنده با باکتری آلوده شود، به مقدار زیادی تکثیر میشود. دی اکسید کربن موجود در متابولیتهای آن باعث میشود pH محلول نگهدارنده از صورتی به زرد تغییر کند. بنابراین، اکثر تولیدکنندگان مواد ضد باکتری را به فرمولاسیونهای خود اضافه کردهاند. عوامل ضد باکتری توصیه شده عبارتند از پنی سیلین، استرپتومایسین، جنتامایسین و پلی میکسین B. سدیم آزید و 2-متیل مهارکنندههایی مانند 4-متیل-4-ایزوتیازولین-3-اون (MCI) و 5-کلرو-2-متیل-4-ایزوتیازولین-3-اون (CMCI) توصیه نمیشوند زیرا این اجزا بر واکنش PCR تأثیر میگذارند. از آنجایی که نمونه ارائه شده توسط این محلول نگهدارنده اساساً یک ویروس زنده است، اصالت نمونه را میتوان تا حد زیادی حفظ کرد و میتوان از آن نه تنها برای استخراج و تشخیص اسیدهای نوکلئیک ویروس، بلکه برای کشت و جداسازی ویروسها نیز استفاده کرد. با این حال، باید توجه داشت که هنگام استفاده برای تشخیص، استخراج و خالصسازی اسید نوکلئیک باید پس از غیرفعالسازی انجام شود.
نوع دیگری از محلولهای نگهدارنده که بر اساس لیزات استخراج اسید نوکلئیک تهیه میشوند، اجزای اصلی آن نمکهای متعادل، عامل کیلیتساز EDTA، نمک گوانیدین (مانند گوانیدین ایزوتیوسیانات، گوانیدین هیدروکلراید و غیره)، سورفکتانت آنیونی (مانند دودکان سولفات سدیم)، سورفکتانتهای کاتیونی (مانند تترادسیل تری متیل آمونیوم اگزالات)، فنل، 8-هیدروکسی کینولین، دیتیوتریتول (DTT)، پروتئیناز K و سایر اجزا هستند. این محلول ذخیرهسازی برای شکافتن مستقیم ویروس برای آزادسازی اسید نوکلئیک و حذف RNase است. اگر فقط برای RT-PCR استفاده شود، مناسبتر است، اما لیزات میتواند ویروس را غیرفعال کند. این نوع نمونه را نمیتوان برای جداسازی کشت ویروس استفاده کرد.
برای عامل کیلیتساز یون فلزی مورد استفاده در محلول نگهدارنده ویروس، توصیه میشود از نمکهای EDTA (مانند دیپتاسیم اتیلندیآمینتترااستیک اسید، دیسدیم اتیلندیآمینتترااستیک اسید و غیره) استفاده شود و استفاده از هپارین (مانند سدیم هپارین، لیتیوم هپارین) توصیه نمیشود تا بر تشخیص PCR تأثیر نگذارد.
۳. لوله نگهدارنده: جنس لوله نگهدارنده باید با دقت انتخاب شود. دادههایی وجود دارد که نشان میدهد پلیپروپیلن (پلیپروپیلن) با جذب اسید نوکلئیک، به ویژه در غلظت یون با تنش بالا، مرتبط است. پلیاتیلن (پلیاتیلن) نسبت به پلیپروپیلن (پلیپروپیلن) ارجحیت بیشتری دارد. DNA/RNA به راحتی در دست گرفته میشود. پلاستیک پلیاتیلن-پروپیلن پلیمر (پلیآلومر) و برخی از ظروف پلاستیکی پلیپروپیلن (پلیپروپیلن) که به طور خاص فرآوری شدهاند، برای نگهداری DNA/RNA مناسبتر هستند. علاوه بر این، هنگام استفاده از سواب شکستنی، لوله نگهدارنده باید سعی کند ظرفی با ارتفاع بیش از ۸ سانتیمتر انتخاب کند تا از پاشیدن و آلوده شدن محتویات هنگام شکستن سواب جلوگیری شود.
۴. محلول نگهداری آب برای تولید: آب فوق خالص مورد استفاده برای محلول نگهداری تولید باید از طریق یک غشای فوق تصفیه با وزن مولکولی ۱۳۰۰۰ فیلتر شود تا از حذف ناخالصیهای پلیمری از منابع بیولوژیکی مانند RNase، DNase و اندوتوکسین اطمینان حاصل شود و تصفیه معمولی توصیه نمیشود. آب یا آب مقطر.
۲. استفاده از لولههای نمونهبرداری ویروس
نمونهبرداری با استفاده از لوله نمونهگیری ویروس عمدتاً به نمونهبرداری از دهان و حلق و نمونهبرداری از بینی و حلق تقسیم میشود:
۱. نمونهبرداری از دهان و حلق: ابتدا زبان را با استفاده از آبسلانگ زبان فشار دهید، سپس سر سواب نمونهبرداری را به داخل گلو ببرید تا لوزههای حلقی دو طرفه و دیواره خلفی حلق پاک شوند و دیواره خلفی حلق را با نیروی سبک پاک کنید، از تماس با واحد زبان خودداری کنید.
۲. نمونهبرداری از بینی و حلق: فاصله نوک بینی تا لاله گوش را با سواب اندازهگیری کرده و با انگشت علامت بزنید، سواب نمونهبرداری را در جهت عمودی بینی (صورت) وارد حفره بینی کنید، سواب باید حداقل نیمی از طول لاله گوش را تا نوک بینی امتداد دهد، سواب را به مدت ۱۵ تا ۳۰ ثانیه در بینی بگذارید، ۳ تا ۵ بار به آرامی بچرخانید و سواب را بیرون بکشید.
از روش استفاده، چه سواب دهانی-حلقی باشد و چه سواب نازوفارنکس، تشخیص اینکه نمونهبرداری یک کار فنی دشوار و آلوده است، کار دشواری نیست. کیفیت نمونه جمعآوریشده ارتباط مستقیمی با تشخیص بعدی دارد. اگر نمونه جمعآوریشده بار ویروسی پایینی داشته باشد، به راحتی میتواند منجر به نتایج منفی کاذب شود و تأیید تشخیص دشوار است.
زمان ارسال: ۲۱ ژوئن ۲۰۲۰
